Методы определения гормонов

Методы определения гормонов

Методы определения гормонов

Выделение и качественный анализ гормонов производят многими методами.

Их подразделяют на четыре основные группы: биологические, химические, иммунологические и методы сатур анионного анализа. Классификация методов определения гормонов в значительной мере условна, так как многие из них являются комбинированными.

Биологические методы определения гормонов базируются на учете специфичности их влияния при тестировании на лабораторных животных или in vitro. Эффект действия гормонов оценивается по изменению массы органов, их гистологического строения, физиологических, биохимических и других показателей.

Например, активность андрогенов определяют по изменениям массы гребня у кастрированных петухов, эстрогенов — по изменениям вагинального эпителия у овариоэктомированных мышей, прогестерона — по сохранению беременности у крольчих и т. п.

Распространенным является метод суммарного определения действия гонадотропинов (ФСГ и ЛГ) по увеличению массы матки у неполовозрелых мышей. Применяют и другие методы, в которых учитывается увеличение массы яичников у неполовозрелых крыс, овуляция у крольчих и т. д.

Определение гонадотропного гормона в СЖК осуществляют на самцах лягушек. Общую активность гонадотропина выражают в мышиных или крысиных единицах по минимальной дозе, которая вызывает на 50% увеличение матки инфантильных мышей или крыс, и сравнивают с международным стандартом.

Согласно международному стандарту фоллитропную активность СЖК определяют по увеличению массы яичников у инфантильных крыс, а лютропную — по уменьшению количества аскорбиновой кислоты в яичниках.

Для учета эффекта действия тиротропина (ТТГ) применяют гравиметрический метод, основанный на определении изменения массы щитовидной железы. Более чувствительным является гистологический метод оценки по изменениям высоты клеток тиреоидного эпителия, размеров фолликулов и состояния коллоида. Биологическую активность пролактина определяют по увеличению зобной железы голубя и т. д.

Методы определения гормонов in vitro зачастую более чувствительны и экономичнее других биологических методов.

Поэтому, в последние годы тестирование активности гормонов, особенно гормонов гипофиза и гипоталамуса, производится in vitro в биологических средах (тканях, гомогенатах, клеточных суспензиях), с последующим определением их содержания флюориметрическим или радиоиммунологическим методами.

Химические и физико-химические методы количественного анализа гормонов в биологических жидкостях и тканях получили широкое распространение. Большинство химических методов определения гормонов основано на использовании реакций, с помощью которых выявляют и учитывают особенности их химической структуры.

Очень часто определение содержания гормонов возможно лишь после их предварительного извлечения и очистки, которые достигаются экстракцией, ультрацентрифугированием, хроматографией, осаждением белков и т. д. Для разделения смеси белковых гормонов часто применяют электрофорез в полиакриламидном геле.

Под действием электрического поля заряженные молекулы гормонов перемещаются в геле. При этом поры геля выполняют функцию «молекулярного сита».

Эффективным методом очистки белковых и пептидных гормонов является ионно-обменная хроматография с применением специальных смол и других компонентов. Для разделения катехоламинов и стероидных гормонов применяют адсорбционную (молекулярную) колоночную хроматографию.

Чаще всего в различных методах хроматографии используют растворители с определенной полярностью, которые под действием капиллярных сил обеспечивают перемещение в слое сорбента исследуемых гормонов. В последние годы для количественного анализа стероидных гормонов применяют газожидкостную хроматографию.

Через колонку газового хроматографа, заполненную гранулами адсорбента с растворителем, с помощью газа-носителя (аргон, водород, азот) продувают нагретую в испарительной камере исследуемую смесь. Выход гормонов из колонки в потоке газа регистрируется детектором.

Для газо-жидкостной хроматохрафии требуется предварительная очистка экстрактов стероидов и их разделение с помощью тонкослойной и других видов хроматографии.

Значительная часть химических методов основана на применении колориметрического и флюоресцентного анализов, которые особенно широко используются для определения содержания стероидов. Поглощение света растворами исследуемых гормонов находится в прямой зависимости от их концентрации.

Чувствительность флюориметрических методов определения гормонов в 10—20 раз выше чувствительности спектрофотометрии.

В последние годы химические и биологические методы определения гормонов частично вытесняются радиоиммунологическими методами, которые оказались менее громоздкими, более чувствительными и специфичными.

Иммунологические методы основаны на способности белковых и полипептидных гормонов индуцировать выработку антител при гетероиммунизации.

Для иммунологического тестирования гормонов применяют реакции связывания комплемента, преципитации и торможения пассивной гемагглютинации.

В связи с наличием иммунологической специфичности белковых гормонов иммунологические методы, разработанные для гормонов одного вида животных, как правило, не могут использоваться для определения тех же гормонов у других видов животных.

В основе методов сатурационного или радиолигандного анализа лежит конкурентное взаимодействие молекул гормона и специфических антител или другого связывающего белка.

При введении в систему для тестирования меченого лиганда — гормона, маркированного радиоактивным изотопом или конъюгированного с каким-либо ферментом, происходит насыщение (сатурация) связывающего белка. При последующем добавлении немеченного гормона (антигена) часть молекул лиганда вытесняется из комплекса с белком.

исследуемого гормона методами сатурационного анализа определяют по калибровочной кривой для различных концентраций стандарта. В методах сатурационного анализа используют специфические белки, обладающие высоким сродством к соответствующим гормонам.

С учетом применения специфических белков (антитела, рецепторные белки тканей, транспортные белки плазмы крови) различают следующие методы: радиоиммунологические (ферментноиммунологические), радиолигандно-рецепторные (радиорецепторные) и конкурентного связывания с белками плазмы.

Чувствительность иммунологических методов при применении специфических антител к гормону, меченных радиоактивным изотопом, значительно увеличивается. В связи с этим их выделяют в отдельную группу и называют радиоиммунологическими.

Эти методы основаны на свойствах немеченного антигена вытеснять меченный антиген из соответствующего комплекса антиген — антитело.

В последние годы, в основном в медицине, радиоиммунологические методы широко применяются для определения инсулина, глюкагона, соматотропина, гонадотропинов (ФСГ, ЛГ) и других гормонов.

Для анализа белковых гормонов перспективен ферментноиммунологический метод. В сравнении с радиоиммунологическим он имеет преимущества, так как в данном случае не требуются радиоактивные изотопы, а гормоны, меченные ферментами, имеют более высокую устойчивость при хранении.

Применяемые меченные йодом-125 гормоны можно использовать только в течение 20 дней, с условием их хранения при температуре —20° С, а меченные ферментами гормоны при стерильном приготовлении не теряют активности в течение 6 мес.

Ферментоиммунологический метод в настоящее время успешно применяется для определения гипофизарных гормонов в крови молодняка крупного рогатого скота.

В последние годы получили применение радиорецепторные методы, которые дают возможность определить содержание активной части гормонов, в то время как радиоиммунологическими методами определяют только их общее содержание.

Клеточные рецепторы приготовляют из матки кроликов, крыс или овец — для определения эстрогенов, из молочной железы кроликов — для определения ЛТГ и СТГ и т. д.

Радиорецепторные методы разработаны и используются для определения эстрогенов, АКТГ, пролактина и других гормонов.

Методы конкурентного связывания с белками плазмы базируются на избирательном сродстве их с соответствующими гормонами и широко применяются для определения количества стероидных и тиреоидных гормонов.

В настоящее время разработаны и широко применяются высокоэффективные радиобиологические методы определения ТТГ-активности, основанные на измерении накопления и выделения радиоактивного йода в щитовидной железе после введения ТТГ и измерении радиоактивности крови и ее сыворотки.

Концентрация ТТГ определяется в нанограммах в I мл сыворотки (нг/мл). Для функциональной характеристики щитовидной железы определяется количество свободного тироксина и трийодтиронина в сыворотке крови с помощью радиоиммунологических и других методов.

Однако в связи с их трудоемкостью часто используют метод определения в сыворотке (плазме) связанного с белком йода (СБИ), так как основная часть СБИ сыворотки крови принадлежит тиреоидным гормонам.

Для определения активности щитовидной железы применяют также пробы поглощения индикаторных доз радиоактивного йода.

Важным условием оценки методов определения гормонов является адекватность их показателей с фактическим содержанием гормонов в организме.

Определение содержания белковых, полипептидных гормонов и производных аминокислот в гипофизе, щитовидной и других железах должно осуществляться с учетом концентрации гормонов в инкретирующих органах и в крови, так как синтез, депонирование и инкреция упомянутых гормонов регулируются разными механизмами. Синтезирующиеся в надпочечниках и гонадах стероидные гормоны не депонируются, содержание этих гормонов в железах адекватно отражает их биосинтез и инкрецию. Методы прямого определения гормонообразования в соответствующих органах имеют преимущества, однако для исследований чаще применяют более доступные косвенные методы определения гормонов и их метаболитов в крови и моче.

Для более полной характеристики функциональной деятельности эндокринных желез, некоторые авторы рекомендуют применять комплексную оценку с учетом их функциональной активности, состояния механизмов регуляции и интенсивности инактивации и выделения гормонов из организма.

Гормональный статус у сельскохозяйственных животных необходимо определять с учетом их вида, породы, типов конституции, продуктивности, возраста, пола, условий кормления и содержания.

Это важно для более эффективного применения гормонов и их аналогов в различных областях животноводства и ветеринарии.

, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Источник: https://www.activestudy.info/metody-opredeleniya-gormonov/

Современные методы определения количества гормонов

Методы определения гормонов

До 60-х годов прошлого столетия об активности большинства гормонов, особенно белково-пептидной природы судили путем использования биологических методов – по выраженности того или иного эффекта после введения гормона. В 1960г. R. Yalow (Р. Ялоу) и S.

Berson (С. Берсон) впервые предложили радиоиммунологический анализ (РИА) для определения инсулина в крови человека. Открытие данного принципа положило начало бурному развитию разработок методов количественного определения гормонов в анализируемых пробах.

К основным преимуществам радиоиммунологического анализа относятся: высокая чувствительность – способность определять минимальные количества вещества, приблизительно равные 10-14 – 10-15моль/л, специфичность, надежность, точность и др.

В основе РИА лежит принцип использования радиоактивной метки для детекции специфических комплексов (антиген-антитело), образующихся в результате иммунологической реакции с исследуемым веществом.

При этом происходит конкурентное взаимодействие двух антигенов: немеченого, представляющего собой определяемый гормон, и меченого аналога этого гормона с включенной радиоактивной меткой.

Связывающий агент – соответствующее тело, вступает в равноправное взаимодействие как с искомым гормоном, так и с его меченым аналогом.

Связывающий агент обладает ограниченной, строго заданной емкостью, и он не может образовывать комплекс сразу со всем количеством меченного и немеченого гормонов. По закону действующих масс происходит связывание гормонов в количествах, пропорциональных их исходным концентрациям:

аГ* аГ* – Ат

Ат

аГ аГ – Ат

аГ* – гормон-антиген с радиометкой

аГ – гормон-антиген искомый, или определяемый

Ат – связующий агент (антитело).

При этом, чем выше содержание искомого (определяемого) гормона в пробе, тем меньшая часть его радиоактивно меченого аналога свяжется с антителом. Следовательно, зная количество связующего агента и меченого гормона, концентрации которых являются величиной заданной, можно рассчитать концентрацию искомого гормона.

В настоящее время разработаны также такие виды радиоиммунологического анализа как иммунорадиометрический, радиорецепторный.

Однако РИА имеет ряд недостатков, в том числе метод требует специального оснащения лабораторий для работы с радиоактивным материалом. Поэтому в начале 1970-х годов было предложено в качестве нерадиоактивного индикатора ферментная метка, когда гормон (антиген) или связующий агент (антитело) химически прочно соединен с ферментом.

При этом ферментативная активность впоследствии после соответствующей обработки пропорциональна количеству определяемого гормона. В последние годы для определения гормонов используется иммунологическая реакция, где в качестве субстрата присоединяются люминофоры – вещества, светящиеся в ультрафиолете (метод иммунохемилюминесцентного анализа).

Уровень свечения измеряется на специальных приборах люминометрах.

Для успешного усвоения темы выполните следующие задания:

№ п/п Задание Методические указания к выполнению задания
1. Изучите гормоны гипоталамуса и гипофиза. 1. Объясните, почему гипоталамус выполняет роль вегетативного центра нервно-рефлекторной и эндокринной регуляции обмена веществ. 2. Охарактеризуйте структуру и роль гормонов гипоталамуса: релизинг-гормонов, статинов и нейрогормонов (вазопрессина, окситоцита) 3. Почему вазопрессин получил название «антидиуретический гормон»? Каковы причины и проявления несахарного диабета? 4. Разберите структуру и биологическую роль соматотропина, фолликустимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, пролактита, тиротропина, кортикотропина. 5. Охарактеризуйте основы автономной саморегуляции систем – гипоталамо-гипофизарно-гонадной, гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной и гипоталамо-гипофизарно-кортикоидной оси.
2. Изучите йодированные гормоны щитовидной железы. 1. Напишите основные этапы биосинтеза йодированных гормонов щитовидной железы. 2. Отметьте особенности транспорта в крови и взаимодействия с рецепторами тироксина и трийодтиронина. 3. Рассмотрите основные физиологические эффекты тиреоидных гормонов, влияние на энергетический обмен, обмен углеводов, липидов и белков. 4. Охарактеризуйте заболевания, связанные с гипер- и гипопродукцией тироксина и трийодтиронина.
3. Изучите пептидные гормоны, регулирующие кальций-фосфорный обмен. 1. Опишите структуру и метаболические функции в костной ткани, почках и тонком кишечнике кальцитонина щитовидной железы. 2. Опишите структуру и влияние на кальций-фосфорный обмен паратгормона.
4. Изучите инсулин поджелудочной железы. 1. Охарактеризуйте особенности структуры и биосинтеза инсулина. Перечислите стимулы, регулирующие инкрецию инсулина. 2. Обратите внимание на рецептор инсулина, обладающего каталитической активностью. 3. Отметьте влияние инсулина на ключевые регуляторные ферменты гликолиза, гликогенеза, апотомического окисления, цикла трикарбоновых кислот, липогенеза, трансляции белка. 4. Выпишите схему молекулярного механизма внутриклеточной передачи гормонального сигнала инсулина.
5. Изучите нарушения обмена веществ при сахарном диабете. 1. Перечислите формы сахарного диабета. Чем они отличаются? 2. Выпишите основные биохимические проявления сахарного диабета: а) б) в) и т.д. 3. Объясните, почему при сахарном диабете нарушается использование глюкозы крови. Укажите ферментативные блоки гликолиза, гликогенеза, пентозофосфатного окисления. 4. Ответьте, почему при сахарном диабете снижается интенсивность цикла трикарбоновых кислот, усиливается глюконеогенез. 5. Напишите реакцию гликозилирования белков при сахарном диабете. 6. Изучите причины, механизмы и последствия усиления при сахарном диабете липолиза и β-окисления жирных кислот. 7. Каковы нарушения использования ацетил-КоА при сахарном диабете? Объясните причину кетонемии и кетонурии при сахарном диабете. 8. Объясните, почему недостаточность инсулина приводит к нарушению биосинтеза нуклеиновых кислот и белка, к усилению протеолиза тканевых белков и катаболизма аминокислот. 9. Дайте определение понятиям «сахарная кривая», почечный «сахарный порог».
6. Изучите структуру и влияние на обмен веществ глюкогона. 1. Опишите структуру и метаболическое влияние глюкогона на обмен углеводов и нейтрального жира. 2. Представьте схему внутриклеточного механизма передачи гормонального сигнала глюкогона на обмен гликогена и нейтрального жира.
7. Изучите гормоны мозгового слоя надпочечников. 1. Напишите химизм реакций биосинтеза норадреналина и адреналина из тирозина. 2. Перечислите физиологические эффекты адреналина и норадреналина: а) 1) б) 2) в) и др. 3) и т.д. 3. Перечислите биохимические эффекты адреналина в печени, мышечной ткани и жировой ткани. 4. Представьте схему аденилатциклазного пути мобилизации гликогена и нейтрального жира при взаимодействии адреналина с β-рецепторами.
8. Изучите пептидные гормоны, регулирующие кальций-фосфорный обмен. 3. Опишите структуру и метаболические функции в костной ткани, почках и тонком кишечнике кальцитонина щитовидной железы. 4. Опишите структуру и влияние на кальций-фосфорный обмен паратгормона.

Подготовьте к занятию протокол лабораторных работ, выписав кратко принцип метода, технику проведения качественных реакций и количественной оценки гормона на практическом занятии, оставляя место для расчетов и резюме.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Источник: https://studopedia.ru/4_28851_sovremennie-metodi-opredeleniya-kolichestva-gormonov.html

Методы определения гормонального статуса

Методы определения гормонов

Клиническая химия гормонов располагает широчайшим спектром методов исследования:

  • прямые физико-химические методы (спектрофотометрические, колориметрические, газо- и жидкостно хроматографические, флюориметрические, полярографические и др.),
  • биологические пробы in vivo и in vitro (требуют наличия вивария и спецоборудования),
  • методики, основанные на связывании гормонов с антителами, транспортными белками крови , рецепторным аппаратом клеток-мишеней (обеспечивают высокую специфичность исследования).

Для количественной характеристики гормонов в настоящее время используется принцип мечения радиоактивным изотопом, ферментом, флюорофором (радиоконкурентные, иммуноферментные, иммунохимические и др. исследования).

Выделяют несколько типов радиолигандного тестирования in vitro:

  • РИА (радиоиммунологический анализ) наиболее известен и этот термин часто используют для всех вариантов подобных in vitro методов, что не вполне корректно,
  • ИРМА (иммунорадиометрический анализ),
  • КБС (конкурентное белковое связывание),
  • РРТ (радиорецепторное тестирование),
  • РЭА (радиоэнзиматический анализ) и РРА (радиореагентный анализ).

В основу этой терминологии положено обозначение используемых реагентов.

 Общей основой исследований является конкуренция немеченых (“холодных”) молекул определяемого вещества и молекул этого же вещества, соединенных с радиоактивной меткой (125I,3H и др.

), за связывание специфическими биндинг-системами. В качестве биндинг-систем могут выступать: иммунная антисыворотка (РИА), специфические тканевые рецепторы (РРТ), белки разных тканей (КБС) и др.

Радиоиммунологические оказались наиболее чувствительными (позволяют определять пикограммовые количества вещества), менее громоздкими (особенно при наличии коммерческих наборов), более воспроизводимыми и достаточно специфичными. Поэтому они чаще всего используются в клинике.

Методические детали проведения радиоиммунного анализа описаны в инструкциях фирм-изготовителей для каждого РИА-комплекта. К ним прилагается истинная калибровочная кривая для каждого конкретного набора на момент его изготовления.

Метод радиоиммунного анализа подразумевает следующие основные этапы:

1. Внесение в пробирку исследуемой пробы или раствора стандарта, меченого антигена, антисыворотки или другого специфического связывающего компонента в присутствии буфера.

Для достижения максимальной воспроизводимости результатов гормон всегда определяется в дублях, а калибровочную кривую строят как можно ближе к истинной, для чего используют три параллельные пробы для каждого стандарта.

Рекомендуется при выполнении процедур раскапывания сыворотки и компонентов РИА-набора пользоваться автоматическими дозаторами.

2. Инкубация проб в оптимальных для каждого набора условиях, что необходимо для установления динамического равновесия между процессами образования и распада иммунных комплексов;

3. Сепарация связанной и свободной фракции немеченого лиганда с последующим центрифугированием и аспирацией или декантированием супернатанта.

Здесь используют широкий спектр методов разделения клиплексов антиген-антитело от непрореагировавших компонентов смеси: фракционное осаждение (этанол, диоксан, полиэтиленгликоль, сульфит натрия, сульфат аммония, трихлоруксусная кислота), адсорбция (активированный уголь, силикаты, гидроксиаппатит), гель-фильтрация (на колонках или добавлением геля в пробирку), электрофорез (крахмальный гель, ацетат целлюлозы. полиакриламидный гель), метод двойных антител (растворимая и твердая фазы), иммобилизованные антитела (на стенках пробирки или на специальных вкладышах).

4. Радиометрия проб и математическая обработка результатов. Большинство наборов для определения гормонов и их метаболитов предполагают осаждение комплекса антиген-антитело и радиометрию осадка (например, при изучении инсулина, кортизола и т.д.

) В некоторых случаях иммунный комплекс не осаждается, а адсорбируется на оставшийся свободным лиганд. поэтому определяется радиоактивность надосадочной жидкости (например, при исследовании простагландинов).

Радиометрию проб часто совмещают с математической обработкой информации (перевод числа импульсов счета каждой пробы в единицы концентрации) и проводят на гамма-счетчиках, гамма-спектрометрах (при использовании в качестве метки 131I, 125I), а также на бета-сцинтилляционных счетчиках (при использовании в качестве метки 3Н), снабженных пакетом специальных программ компьютерной обработки данных.

Конечные результаты выражают в единицах, рекомендованных фирмами-изготовителями наборов для построения калибровочных кривых из стандартных навесок определяемых веществ.

Пересчет результатов радиометрии проб в единицах концентрации или активности производятся методом построения калибровочной кривой, для чего используются стандарты с известным количеством немеченого соединения.

По мере увеличения концентрации лиганда в стандарте количество радиоактивных комплексов уменьшится и, следовательно, снижается радиоактивность получаемого осадка (обозначают стандарты – В).

Наибольшей радиоактивностью обладает осадок в пробирках, не содержащих немеченый антиген (так называемый нулевой стандарт – ВО).

При построении калибровочного графика по оси ординат откладывают процент связывания метки – отношение (В/ВО)´100%, по оси абсцисс – единицы концентрации (активности) стандартов. Существует несколько способов построения стандартной кривой, из них методом выбора в обработке результатов РИА считается сплайн-интерполяция.

Помимо нулевого стандарта и стандартов гормона используются еще две пробы: Т- тотальная, которая содержит только метку и характеризует ее активность; НСВ – проба на неспецифическое связывание, которая содержит все составные части РИА-набора, кроме антитела, и позволяет определить неспецифическое связывание метки разделяющими компонентами и стенками пробирки.

Неспецифическим связыванием определяемого гормона очень часто обладает сама сыворотка или плазма крови.

Если процент неспецифического связывания (отношение НСВ/Т´100%) не превышает 5, то его можно не учитывать, если же он в неизвестных пробах больше 5, то его нужно вычислять для каждой пробы (что очень удорожает исследование) или проводить экстракцию гормона из плазмы крови.

Это делается при определении вазопрессина, соматостатина, циклических нуклеотидов, тестостерона, простагландинов и ряда других гормонов и биологически активных веществ.

Однако метод РИА не в состоянии заменить все остальные аналитические методы, а для большой группы стероидных гормонов и их метаболитов химические методы по-прежнему остаются актуальными.

Не утратили значения в силу своей специфичности и отдельные биологические методы определения гормонов.

В клинической практике просматривается тенденция к комплексным исследованиям, поскольку отдельно взятый тест часто малоинформативен и позволяет судить лишь об одном звене гормональной системы.

Источник: https://biokhimija.ru/gormon-obmen/methods.html

Современные методы гормонального анализа

Методы определения гормонов

Современные методы гормонального анализа

Проф. Н.П. ГОНЧАРОВ

Modern methods of hormonal analysis

N.P. GONCHAROV

ФГУ Эндокринологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации, Москва

Представлена характеристика основных методов определения гормонов, включая радиоиммунологические и иммуно-ферментные, а также подробно описаны современные методы иммуноанализа третьего поколения, обладающие высокой чувствительностью, что позволяет определять практически весь основной спектр гормонов и биологически активных соединений. Это открывает новые возможности в диагностике субклинических форм эндокринной патологии.

Ключевые слова: гормоны, методы анализа.

Characteristics of the main methods for hormone detection and measurement including radioimmune and immunoenzyme assays are presented along with the detailed description of up-to-date highly sensitive immunoassays of the third generation.

These methods are described as allowing determination of virtually the entire range of hormones and biologically active compounds. Their application opens up new opportunities for diagnostics of subclinical forms of endocrine pathology.

Key words: hormones, hormonal assays.

Одним из определяющих достижений современной биологии и медицины является создание во второй половине ХХ века методов радиоиммунологического определения гормонов и других биологически активных соединений в различных средах и тканях организма, позволяющих адекватно оценить функциональное состояние эндокринной или любой другой физиологической системы.

Появление радиоиммунологических методов относится к 1960 г., когда две независимые группы исследователей Yalow и S. Вегеоп в США и R.

Ек1п в Великобритании) впервые описали метод определения инсулина и тироксина с помощью са-турационного анализа, основанного на принципе радиоиммуноанализа (РИА).

В первом случае в качестве связывающего компонента были использованы антитела к инсулину, во втором — специфический транспортный белок к тироксину. Работа, посвященная РИА-методу определения инсулина, была удостоена Нобелевской премии.

Впоследствии были созданы и другие методы иммуноанализа. В отличие от ранее использовавшихся биологических и химических методов, иммунологические методы обладают значительными преимуществами.

В настоящее время радиоиммунологические и родственные им неизотопные методы образуют в совокупности единую биотехнологическую систему, позволяющую определять практически неограниченный спектр веществ. Доступность и широкое использование этих методов в виде коммерческих стандартизованных наборов приобретают опреде-

ляющее значение в развитии многих направлений в биологии, медицине и ветеринарии. Различные методы иммуноанализа позволяют определять различные биологически активные вещества с чувствительностью в диапазоне концентраций от 10-6 до 10-12 М и выше.

Общие принципы иммуноанализа

Основополагающим компонентом любого метода иммуноанализа являются антитела — поли-клональные и моноклональные, получаемые in vivo.

Антитела, присутствующие в антисыворотке, обычно имеют молекулярную массу более 150 кД и принадлежат к классу иммуноглобулинов (Ig). Обычно в антисыворотке доминируют IgG, IgA и IgM.

Варианты в структуре аминокислотных остатков Ig определяют различия в местах связывания антигена. Теоретически считается, что таких мест связывания может насчитываться до 1010.

Основной принцип иммуноанализа — это реакция антитела с антигеном. При взаимодействии антитела (АЬ) и антигена (Ag) образуется комплекс (Ab:Ag) по формуле: Ab+AgAb:Ag.

Для методов иммуноанализа биологически активных соединений необходимы следующие составляющие:

—высокоочищенный антиген для иммунизации;

— антисыворотка с высокоспецифичными антителами;

— высокоочищенный меченый антиген с максимально высокой специфической активностью;

© Н.П. Гончаров, 2011 86

e-mail: goncharovN@endocrincentr.ru

— технология разделения свободного антигена от антигена, связанного с антителами.

Краткая характеристика основных компонентов

иммуноанализа

Антитела

Необходимо всегда помнить, что при разработке любых методов иммуноанализа определяющую роль играет оптимальный выбор высокоспецифических антител независимо от системы регистрации сигнала используемого меченого компонента. Нередко в коммерческих наборах выбор антител не оптимален, что может приводить к диагностическим ошибкам.

Поликлональная антисыворотка содержит несколько тысяч различных типов молекул IgG. Принципиальное отличие моноклональных антител — их идентичность. Они предпочтительнее в методе конкурентного иммуноанализа, так как меченый и определяемый антиген (вещество) конкурируют за один и тот же центр связывания.

Знание специфичности их эпитопов имеет существенное преимущество при создании «сандвич»-анализа.

Моноклональные антитела легко получать в больших количествах с помощью гибридомной технологии, что обеспечивает возможность стандартизации метода и тем самым воспроизводимость полученных результатов в течение длительного отрезка времени.

Применение мо-ноклональных антител для иммуноанализа пептидных гормонов требует большой осторожности, так как их высокая специфичность может приводить к связыванию только одной изоформы того или иного гормона. Этот эффект может проявляться также при аффинной очистке пептидов.

Стандарты

Для пептидных и гликопротеиновых гормонов используются международные стандарты ВОЗ. Работу по их созданию и обновлению координирует отдел биологических стандартов Национального института медицинских исследований в Лондоне.

Систематическая информация о стандартах публикуется в докладах ВОЗ.

Высокоочищенные стандарты для низкомолекулярных соединений, например для стероидов, можно приобретать у коммерческих фирм или из международной коллекции стандартов стероидов в Национальном институте здоровья США.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Одной из причин несоответствия между стандартами является природная гетерогенность их молекулярной структуры, которая наблюдается в случае гликопротеиновых гормонов (тиреотроп-ный гормон — ТТГ, лютеинизирующий гормон — ЛГ, фолликулостимулирующий гормон — ФСГ), а также пролактина (Прл) и гормона роста (ГР). изоформ гормонов и их соотношение изменяется в зависимости от источника и технологии

получения гипофизарных гормонов. Другими причинами, влияющими на качество стандартов, могут быть процесс лиофилизации, а также условия и продолжительность их хранения.

Матрикс

Для разбавления стандарта часто используют сыворотки, буферные и белковые растворы. Состав этих растворов или «матриксов» может влиять на реакцию антиген—антитело, в результате чего возникают серьезные систематические ошибки, которые сопровождаются нарушением воспроизводимости результатов анализа.

Это довольно распространенное в иммуноанализе явление обозначают «эффектом матрикса». Принцип сопоставимости анализов заключается в том, чтобы анализируемое вещество в пробе взаимодействовало в тех же условиях, что и в стандартном растворе.

Матриксные эффекты чаще всего влияют на определение ТТГ, общих трийод-тиронина — ТЗ, тироксина — Т4, Прл, ФСГ, ЛГ и стероидов, если они предварительно не выделены из пробы экстракцией.

Для диагностического мониторинга и проведения научных исследований используются следующие основные методы гормонального иммуноана-лиза: метод радиоиммунного анализа, иммунофер-ментный метод (ИФА), сверхчувствительные методы третьего поколения, основанные на измерении усиленного люминесцентного сигнала или регистрации вычлененного во времени флюоресцентного сигнала и электрохимический метод иммуноанализа с использованием высокопроизводительных автоматических анализаторов ряда зарубежных фирм.

Методы радиоиммуноанализа

Неотъемлемым компонентом радиоиммунологического метода является применение радиоактивной метки (трития — 3Н или 1251) с высокой удельной активностью. Регистрация сигнала осуществляется с помощью специальных гамма- (для 1251) или бета-(для 3Н) счетчиков.

Наряду с достоинствами, общими для всех иммунологических методов, РИА-методы имеют и ряд недостатков. К ним в первую очередь относится использование радиоактивного материала (3Н или 1251).

Для персонала лаборатории наличие в наборе радиоактивности не представляет опасности.

Короткий период полураспада 1251 (4—5 нед) также ограничивает время использования РИА-наборов и тем самым снижает их диагностическую эффективность.

Неизотопные методы исследования

Создание 30 лет назад метода включения фермента в антитело или определяемый антиген обеспечило быстрое развитие иммуноферментных методов иммуноанализа. Наиболее широко в качестве

меченого компонента используются пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). ELISA получил наиболее широкое распространение при определении гормонов в эндокринологии. В качестве твердофазных носителей наиболее широко используются полистироловые микропланшеты.

В ELISA используются конъюгаты антител с ферментом, которые, реагируя с соответствующими «хромогенными» субстратами, образуют окрашенные соединения с определенными оптическими характеристиками. Этот метод более производителен по сравнению с классическими жидкофазными методами РИА и ИФА.

Однако необходимо помнить о недостатках метода. В частности, высокую точность измерений могут обеспечить только специальные анализаторы.

Кроме того, свойства и качество полистироловых микропланшет, используемых в ELISA, при недостаточно оптимальной технологии их производства могут изменяться от партии к партии и даже от лунки к лунке, что драматически влияет на качество и воспроизводимость гормонального анализа.

Высокочувствительные методы третьего

поколения

Флюоресцентный иммуноанализ. Существует несколько разновидностей данного метода. В последние 30 лет большое распространение в гормональной диагностике получил иммуноанализ с флюоресценцией, отсроченной во времени (Delfia), где в качестве метки используется редкоземельный элемент европий.

Это принципиально новый тип иммуноанализа. Дельфия позволяет определять стероидные гормоны в пикограммовых количествах, а гипофизарные — в концентрациях от 0,03 мЕд/л (для ТТГ) до 0,15 мЕд/л (для Прл). Дельфия является технологией выбора при проведении скрининга на врожденный гипотиреоз и ВДКН.

Люминесцентный иммуноанализ. Наиболее оптимальными методами иммуноанализа являются фотоэмиссионные или люминесцентные методы. Наибольшее применение в иммуноанализе получил метод с усилением люминесцентного свечения.

Метод усиленной люминесценции

Усиление реакции люминесценции достигается добавлением люминогенного субстрата, люми-нола или изолюминола и специального усилителя.

Последний резко усиливает интенсивность и продолжительность свечения, что и обеспечивает высокую чувствительность и воспроизводимость метода. Световой сигнал регистрируется специальным анализатором (люминометры).

Метод высокопроизводителен, обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Он наиболее оптимален при обследовании населения на гипотиреоз, так как по-

зволяет определять свободный тироксин в концентрации 8 пмоль/л. Высокая чувствительность определения низкого уровня ТТГ (

Источник: https://cyberleninka.ru/article/n/16861900

Моя железа
Добавить комментарий